酶的分離很簡單，但是很麻煩，需要很長時間。
酶的分離純化方法簡介
生物細胞產生的酶有兩種:壹種是細胞內產生並分泌到細胞外的酶，稱為胞外酶。這些酶大多數是水解酶。例如，用於葡萄糖酶促生產的兩種澱粉酶是由枯草芽孢桿菌和根酶在發酵過程中分泌的。這類酶壹般含量高，容易獲得；另壹種酶在細胞內產生後並不分泌到細胞外，而是在細胞內起催化作用。稱之為細胞內酶的發酵生產中的壹系列化學反應，如檸檬酸、肌苷酸、谷氨酸壹鈉等，是在細胞內各種酶的催化下進行的。在細胞中，酶往往與細胞結構結合在壹起，有壹定的分布面積，催化的反應有壹定的順序，從而使許多反應有序進行。
酶的來源大多是生物細胞。雖然生物細胞產生的酶總量很高，但每種酶的含量很低。比如胰腺的中間消化過程中有很多種水解酶，但每種酶的含量差別很大。
所以在提取壹種酶的時候，首先要選擇酶含量最豐富的材料，比如胰腺，是提取胰蛋白酶、糜蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶的好材料。由於從動物內臟或植物果實中提取酶制劑受原料限制，如果不能綜合利用，成本很高。目前工業上大量酶制劑是通過培養微生物獲得的。利用微生物生產酶制劑有很多優點，不受氣候和地理條件的限制。而且動植物中的大多數酶都可以在微生物中找到，微生物可以快速繁殖，產生豐富的酶。還可以通過選育菌種來提高產量，並且可以用廉價的原料大量生產。
在生物組織中，除了我們需要的那壹種以外，往往還有許多其他的酶、蛋白質和其他雜質。因此，在制備酶制劑時，必須經過分離和純化的程序。
酶是壹種具有催化活性的蛋白質，蛋白質容易變性，因此在酶的純化過程中應避免使用強酸強堿，並保持較低的溫度。在純化過程中，通過測定其催化活性，更容易追蹤酶在分離純化過程中的去向。酶的催化活性也可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標。在酶的整個分離純化過程的每壹步，都要壹直測定酶的總活性和比活性，從而知道通過某壹步回收了多少酶，純度提高了多少，從而決定了某壹步的選擇。
酶的分離和純化通常包括三個基本步驟:提取、純化、結晶或制備。先將所需的酶從原料中引入到溶液中，溶液中不可避免地帶有壹些雜質，然後將酶從溶液中選擇性分離出來，或者將雜質從溶液中選擇性去除，再制成純化的酶制劑。下面全面介紹酶分離純化的常用方法:
壹、預處理和固液分離技術
1.細胞破裂
高壓均質機法:這種方法可以用來粉碎酵母、大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌甚至黑曲黴。當細胞懸液在高壓下被引入壹個孔徑可調的排放孔時，當細菌從高壓環境轉移到低壓環境時，細胞很容易破碎。菌懸液壹次通過均質機的細胞破碎率為12%-67%。細胞破碎率與細胞類型有關。為了達到90%以上的細胞破碎率，至少細菌懸液應該通過勻漿器兩次。最好增加手術壓力，減少手術次數。但據報道，當操作壓力達到175Mpa時，破碎率可達100%。當壓力超過70Mpa時，細胞破碎率上升緩慢。高壓均質機的閥門是影響細胞破碎率的重要因素。絲狀細菌會堵塞均質機的閥門，尤其是當細菌濃度較高時。生長在豐富培養基上的大腸桿菌比生長在合成培養基上的大腸桿菌更難破碎。
細菌酶處理:蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來溶解細胞。具體來說，將43 kg溶壁微球菌置於0.5%氯化鈉溶液中，使細胞濃度為5%(幹重)，用0.68kg(幹重)蛋清在35℃處理20分鐘，所得細胞碎片用等體積乙醇處理。通過離心去除細胞碎片和細胞內蛋白質，然後將乙醇濃度增加至75%。
離心
離心分離過程可分為三種:離心過濾、離心沈澱和離心分離。使用的設備有過濾離心機、沈降離心機和離心機。過濾離心機的筒壁上有小孔，筒壁上有過濾介質，壹般可以用來處理懸浮固體顆粒大，含固量高的場合。沈降離心機用於低固體濃度的固液分離，如發酵液中的菌體、鹽析法處理的蛋白質或有機溶劑等。分離器用於分離兩種密度略有差異的不相溶的乳狀液或含有微量固體顆粒的乳狀液。
生物領域使用的離心機系統除了要滿足離心機的壹般要求外，還要滿足生物生產的技術要求，包括滅菌、冷卻、密封等，以保證產品不受汙染，環境不受汙染。現代離心裝置包括以下三個步驟，以及程序控制:離心、離心系統的滅菌和現場清洗。比如阿爾法-拉瓦公司的離心機產品，有雙軸向密封，由安裝在轉鼓上下主軸上的碳化矽動環和定環組成。密封采用水連續冷卻和潤滑，可防止產品被汙染和生產過程中排放的廢棄物汙染環境。離心機就像壹個密閉的壓力容器，可以在121℃的溫度下進行蒸汽滅菌。離心機在離心機轉鼓周圍裝有冷卻夾套，可以充分冷卻懸浮液和濃縮固體，有效控制溫度，這對生物制品非常重要。如BTPX205離心機可用於細胞收集、培養液純化和細胞碎片分離，可用於疫苗、酶制劑等的提取。機器的其他輔助系統和控制系統也比較完善，如壓力指示器、測力計、溫度傳感器、液位傳感器等。
3.膜分離技術
超濾是蛋白質純化過程中使用的主要膜分離技術。在靜壓力的作用下，溶液通過孔徑很小的濾膜，使溶液中分子量較小的溶質通過膜，而大分子被截留在膜表面。大多數超濾膜由非常薄的功能膜和厚的支撐膜組成。功能膜決定膜的孔徑大小，而支撐膜提供機械強度以抵抗靜壓。超濾濃縮的優點是:操作條件溫和，不發生相變，不破壞生物活性物質。
超濾系統主要由料液儲罐、泵、超濾器和滲透液收集罐組成。料液由泵泵入超濾器，水和低分子量物質從超濾器排出，濃縮後的料液在料液儲罐、泵和超濾器中循環。當料液濃縮到壹定倍數時，可作為濃縮料液進壹步處理。
超濾應用於蛋白質物質的濃縮和脫鹽時，應註意以下問題:壹是在超濾循環過程中，由於泵和葉輪與料液之間的放熱摩擦，料液溫度會逐漸升高，造成蛋白質分子的損失。因此，料液儲罐應配有冷卻系統和自動溫度測控系統。其次，某些酶中輔因子的損失是壹個問題:有些酶含有分子量小的輔因子，超濾時容易從透過液中除去，所以超濾前或超濾後要加入壹定濃度的輔因子。
超濾也可以與親和層析結合以提高分離純度。其工作原理是:當溶液中待分離的蛋白質暢通無阻地通過超濾膜的微孔時，如果膜的壹側結合有親和配體，蛋白質就會與配體結合，從而在膜的這壹側聚結。其他不與配體結合的物質將通過該孔被帶走。然後，用合適的洗脫劑洗脫蛋白質，洗脫劑用於進壹步分離和純化。
4.泡沫分離
原理:當向含有多種組分的溶液中通入氣體時，由於這些組分的表面活性不同，壹些組分會在溶液表面形成泡沫，而泡沫的穩定性取決於操作條件和溶液的生物特性。泡沫中含有較多的表面活性成分，因此泡沫成分的種類和含量與溶液中不同。這樣，溶液中的組分可以分離。
蛋白質容易吸附在氣液界面上，有利於其結構的穩定。泡沫分離過程是:蛋白質從主溶液向氣液界面擴散，可能是可逆的，也可能是不可逆的；分子重新排列，壹般認為在空氣-水界面會形成兩種類型的膜，壹種是薄膜，壹種是厚膜，可能會造成多個分子聚集在壹起的現象。在氣-液界面形成的蛋白質膜可以是單層或多層的。膜的類型取決於主溶液和氣液界面上蛋白質的特性、結構和濃度。
泡沫分離的目的是另壹方面提高酶蛋白的富集率(泡沫中的蛋白濃度/初始溶液中的蛋白濃度)和酶蛋白的提取率(泡沫中的蛋白提取率/初始蛋白質量)，或者使壹種組分在多組分混合物中的分配系數最大化。
第二，提取
存款
1.鹽析
常用的鹽析劑是硫酸銨，溶解度高，價格低。硫酸銨沈澱蛋白質的能力很強，其飽和溶液可以沈澱大部分蛋白質。對酶沒有破壞作用。
pH值的控制:應考慮酶的溶解性和穩定性。當達到酶的等電點時，其溶解度最小，容易沈澱。但有些酶在再次達到等電點時就不穩定了，要選擇最佳的pH值。壹般要在酶的pH值最穩定的前提下，考慮最適合酶沈澱的pH值。操作中壹旦確定了最適pH值，甲酸或堿應在加入硫酸銨前調節酶液的pH值，避免溶液pH值的波動，以免破壞酶的穩定性。加入硫酸銨時註意攪拌，註意加入硫酸銨的速度，壹般由少到多，慢慢加入硫酸銨，盡可能磨成細粉。
溫度控制:有些酶在較高溫度下穩定性較好，在室溫下可以鹽析出來，而對於大多數酶來說，要盡量在低溫下操作。
酶液凈置:加入硫酸銨後，要讓酶液靜置壹段時間，使酶蛋白完全沈澱。酶靜置後，不應再攪拌。
2.有機溶劑沈澱
有機溶劑的選擇:可用於酶蛋白沈澱的有機溶劑包括醇類，如甲醇、乙醇、異丙醇等。乙醇親水性好，可以防止蛋白質變性，酶蛋白在其中的溶解度也低。
有機溶劑沈澱操作:有機溶劑壹般會使蛋白質變性，溫度高時變性的蛋白質分子會變成永久失活。因此，最好在0℃以下用有機溶劑處理。有機溶劑沈澱的酶蛋白不宜放置過久，應盡快溶解於水中。
3.高分子絮凝劑沈澱
高分子絮凝劑，如葡聚糖、聚乙二醇等，與酶分子競爭水分子，具有脫水作用使酶沈澱。聚乙二醇作為沈澱劑的優點是在水溶液中濃度可達50%，濃度為6%-12%的蛋白質大部分可以沈澱出來。這種試劑不需要低溫操作，對蛋白質的穩定性也有壹定的保護作用。聚乙二醇不會被吸附，所以不需要在離子交換吸附前去除。
4.用金屬離子和絡合物沈澱
酶和其他蛋白質可以形成低溶解度的金屬鹽。用金屬離子沈澱的缺點是酶與金屬離子作用後，可逆變化差，特別是與巰基衍生物作用，會催化酶的變性和失活。
5.使用特殊試劑沈澱法
鏈黴素可以選擇性地去除核酸，從而沈澱胞內酶。鏈黴素鹽(濃度為0.5-1.0mg/mg蛋白)選擇性沈澱核酸的效果優於錳離子，且酶不易失活。
6.親和沈澱
親和沈澱技術是將親和反應的高選擇性和低通量與沈澱操作的高通量和選擇性有機結合起來而形成的。配體與可溶性載體偶聯形成載體-配體復合物，在壹定條件下與生物分子結合後可以沈澱。
配體-載體復合物可以選擇性地與蛋白質結合，溶液的pH值、離子強度、蛋白質濃度等條件對親和結合的影響很小。只有競爭性配體才會降低產物與原配體的親和結合，甚至逆轉親和結合。
誘導沈澱的方法有:離子交聯；加入帶相反電荷的聚合物；加入帶相反電荷的疏水基團；改變pH值誘導疏水沈澱；溫度引起的沈澱。
親和結合:將親和配體加入到含有目標蛋白的溶液中，調節與沈澱相關的條件以促進親和結合。
洗滌:對於處理過的粗液中的親和沈澱，可能發生非特異性結合，尤其是當使用帶電聚合物時。離子交換的作用會使其他蛋白質壹起沈澱，所以在分離目標物之前要對沈澱物進行洗滌。方法如下:加入適當的清洗劑重新溶解沈澱，然後沈澱；或者在特定洗脫之前，徹底洗滌沈澱物。在上述過程中，感興趣的蛋白質應該始終保持與配體的親和結合狀態。
配體-載體復合物與目標蛋白的分離:分離後需要保證目標蛋白和配體-載體復合物的回收，目標蛋白要達到壹定的純度，並有較高的回收率。