膜體系酵母雙雜選擇載體是根據誘餌蛋白質定位的不同來選擇,有利於互作蛋白相連的泛素NubG和Cub-LexA-VP16相互作用,被UBPs識別,從而啟動下遊報告基因表達。那麽膜體系有哪些載體?具體要如何選擇?下面小正給您支支招。
1、膜體系有哪些誘餌載體?
膜體系酵母雙雜交有三種誘餌載體,分別如下:
pBT3-N
pBT3-SUC
pBT3-STE
2、如何選擇載體?
根據蛋白結構域的不同,選擇的載體有所區別,下表中我們總結了不同情況下適合選擇的載體。
那麽怎麽預測蛋白的結構域呢?具體預測流程如下:
1、CDS序列翻譯為氨基酸序列
/tools/translate.html
2、蛋白跨膜結構域預測
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0
3、蛋白信號肽預測
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
4、蛋白結構域預測
http://smart.embl-heidelberg.de/
三、膜體系篩庫交付標準?
什麽樣的膜體系篩庫結果是合格的呢?小正帶您直觀體驗膜體系篩庫的交付金標準,以使用pBT3-STE篩選膜體系文庫為例,***計七大步驟和七大結論。
1、誘餌載體構建
結論1:通過壹代測序比對載體是否正確。
2、誘餌載體功能驗證
結論2:構建的誘餌載體是否存在移碼突變,泛素特異性蛋白酶系統功能是否可以正常發揮功能,是否進行後續篩選實驗。結果顯示可以進行後續篩選試驗。
3、自激活及毒性檢測
結論3:誘餌載體pBT3-STE-XXX是否存在自激活,是否可以後續篩選實驗。結果顯示可以進行後續篩選試驗。
4、酵母文庫初篩
結論4:通過初篩***篩選到多少個單克隆。
5、對初篩結果進行復篩
結論5:通過復篩***篩選到多少個陽性克隆。
6、回轉驗證
結論6:對酵母陽性克隆質粒進行回轉驗證,確定有多少個真陽性基因。
7、點板驗證
結論7:(可依據文章需求,進行個性化展示)確定是否跟回轉驗證結果壹致。